粘附性大腸桿菌(EAEC)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)

【包裝規格】48 份/盒

【檢測方法】RT-PCR 熒光探針法

【檢驗原理】

本試劑盒用特異性引物，結合一條特異性熒光探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術對粘附性大腸桿菌(EAEC)RNA 進行體外擴增檢測，僅用于科研使用。

【試劑組成】

粘附性大腸桿菌(EAEC)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融少于 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJOpticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

剖檢豬取腸內容物和腸系膜**結；待檢活豬，取排泄物，于離心管中。

【保存和運輸】

上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過 6 個月，標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區）

1.1樣本前處理

組織：分別從腸系膜**結的 3 個不同位置取樣，稱取樣品約 1g，用手術剪剪碎混勻，再稱取 0.05g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL **離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100uL 于 1.5mL **離心管中；排泄物：取 0.05g 于 1.5mL **離心管中，加入 1mL生理鹽水渦旋振蕩，8000rpm 離心 2min，取上清液 100uL 于 1.5mL **離心管中。

1.2RNA 提取

RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請按照試劑盒說明書進行操作。

2. 試劑配制（試劑準備區）

粘附性大腸桿菌(EAEC)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿 7 份，多配制 1 份)，每測試反應體系配制如下表：

3. 加樣（樣本處理區）

將步驟 1 提取的 RNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μl，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR 擴增（核酸擴增區）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25ul；熒光通道選擇：

檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇 ROX 參比熒光。

4.3推薦循環參數設置：

5. 粘附性大腸桿菌(EAEC)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)結果分析判定

5.1結果分析條件設定

設置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15范圍內調節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節)，以及 Threshold 的 Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數增長曲線；

可疑：檢測通道 35.0<Ct 值≤37，建議重復檢測，如果檢測通道仍為 35.0<Ct值≤37，且曲線有明顯的增長曲線，判定為陽性，否則為陰性；

陰性：樣本檢測結果 Ct 值>37 或無 Ct 值。

6. 檢測方法的局限性

? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

? 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；

? 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

7. 質控標準

陰性質控品：無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且 Ct 值≤32；

以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

8. 產品性能指標

陰陽性參考品符合率：5 份陽性參考品符合率為 100％；10 份陰性參考品符合率為 100％。

*低檢測限：5.0×102copies/ml。

精密度：批內、批間精密度檢測 Ct 值的變異系數（CV）均小于等于 3%。

粘附性大腸桿菌(EAEC)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)【注意事項】

? 所有操作嚴格按照說明書進行；

? 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完全混勻并短暫離心；

? 反應液應避光保存；

? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；

? 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物**通則》進行處理。

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