急性壞死性肝胰腺炎**(AHPND)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?
【包裝規(guī)格】48 份/盒
【檢測(cè)方法】RT-PCR 熒光探針?lè)?
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒用特異性引物，結(jié)合一條特異性熒光探針，用一步法熒光 RT-PCR 技術(shù)對(duì)急性壞死性肝胰腺炎**(AHPND)RNA 進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測(cè)，僅用于科研使用。
【試劑組成】
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名 稱(chēng)
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規(guī) 格
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酶液
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50μl×1 管
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反應(yīng)液
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1.0ml×1 管
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陽(yáng)性質(zhì)控品
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50μl ×1 管
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陰性質(zhì)控品
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250μl ×1 管
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急性壞死性肝胰腺炎**(AHPND)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?說(shuō)明：不同批號(hào)的試劑盒組分不可交互使用。
【儲(chǔ)存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運(yùn)輸、反復(fù)凍融少于 5 次，有效期 12 個(gè)月。
【適用儀器】
ABI 7300、7500、ABI stepone / stepone plus 、安捷倫 MX3000P/3005P、MJOpticon2 等其他熒光定量 PCR 檢測(cè)儀。
【標(biāo)本采集】
剖檢豬取腸內(nèi)容物和腸系膜**結(jié)；待檢活豬，取排泄物，于離心管中。
【保存和運(yùn)輸】
上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃，長(zhǎng)期保存可置-70℃，但不能超過(guò) 6 個(gè)月，標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用 2~8℃冰袋運(yùn)輸，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）
1.1樣本前處理
組織：分別從腸系膜**結(jié)的 3 個(gè)不同位置取樣，稱(chēng)取樣品約 1g，用手術(shù)剪剪碎混勻，再稱(chēng)取 0.05g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5mL **離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100uL 于 1.5mL **離心管中；排泄物：取 0.05g 于 1.5mL **離心管中，加入 1mL生理鹽水渦旋振蕩，8000rpm 離心 2min，取上清液 100uL 于 1.5mL **離心管中。
1.2RNA 提取
RNA 提取試劑盒（離心柱提取法），請(qǐng)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。
2. 試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
急性壞死性肝胰腺炎**(AHPND)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?根據(jù)待檢測(cè)樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對(duì)照+1 管陽(yáng)性對(duì)照；樣品每滿(mǎn) 7 份，多配制 1 份)，每測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
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試劑
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反應(yīng)液
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酶液
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用量
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20μl
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1μl
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3. 加樣（樣本處理區(qū)）
將步驟 1 提取的 RNA、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 4μl，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）
4.1將待檢測(cè)反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；
4.2設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25ul；熒光通道選擇：
檢測(cè)通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請(qǐng)勿選擇 ROX 參比熒光。
4.3推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：
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步驟
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循環(huán)數(shù)
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溫度
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時(shí)間
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收集熒光信號(hào)
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1
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1cycle
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42℃
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20min
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否
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2
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1 cycle
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95℃
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10min
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否
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3
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40 cycle
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94℃
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15sec
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否
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55℃
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30sec
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是
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5. 急性壞死性肝胰腺炎**(AHPND)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?結(jié)果分析判定
5.1結(jié)果分析條件設(shè)定
設(shè)置 Baseline 和 Threshold：一般直接按機(jī)器自動(dòng)分析的結(jié)果分析，當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時(shí)，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 start 值(一般可在 3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop 值(一般可在 5~20 范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及 Threshold 的 Value值(上下拖動(dòng)閾值線至高于陰性對(duì)照)，重新分析結(jié)果。
5.2結(jié)果判斷
陽(yáng)性：檢測(cè)通道 Ct 值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長(zhǎng)曲線；
可疑：檢測(cè)通道 35.0<Ct 值≤37，建議重復(fù)檢測(cè)，如果檢測(cè)通道仍為 35.0<Ct值≤37，且曲線有明顯的增長(zhǎng)曲線，判定為陽(yáng)性，否則為陰性；
陰性：樣本檢測(cè)結(jié)果 Ct 值>37 或無(wú) Ct 值。
6. 檢測(cè)方法的局限性
? 樣本檢測(cè)結(jié)果與樣本收集、處理、運(yùn)送以及保存質(zhì)量有關(guān)；
? 樣本提取過(guò)程中沒(méi)有控制好交叉污染，會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；
? 陽(yáng)性對(duì)照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；
? 病原體在流行過(guò)程中基因突變、重組，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
? 不同的提取方法存在提取效率差異，會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果；
? 試劑運(yùn)輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測(cè)效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測(cè)不準(zhǔn)確的結(jié)果；
? 本檢測(cè)結(jié)果僅供參考，如須確診請(qǐng)結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測(cè)手段。
7. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)
陰性質(zhì)控品：無(wú)明顯擴(kuò)增曲線或無(wú) Ct 值顯示；
陽(yáng)性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長(zhǎng)期，且 Ct 值≤32；
以上條件應(yīng)同時(shí)滿(mǎn)足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。
8. 產(chǎn)品性能指標(biāo)
陰陽(yáng)性參考品符合率：5 份陽(yáng)性參考品符合率為 100％；10 份陰性參考品符合率為 100％。
*低檢測(cè)限：5.0×102copies/ml。
精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。
急性壞死性肝胰腺炎**(AHPND)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?【注意事項(xiàng)】
? 所有操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；
? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心；
? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；
? 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專(zhuān)用工作服；
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；
? 實(shí)驗(yàn)完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺(tái)和移液器；
? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對(duì)待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物**通則》進(jìn)行處理。
狂犬病毒核酸檢測(cè)試劑盒（PCR-熒光探針?lè)ǎ?規(guī)格：48人份/盒 精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。
炭疽桿菌(BA)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)? 規(guī)格：48人份/盒 精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。
猴痘病毒(MPV)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)? 規(guī)格：48人份/盒 精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。
鉤端螺旋體(Lep)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)? 規(guī)格：48人份/盒 精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。
布氏桿菌(BS)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)? 規(guī)格：48人份/盒 精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。
豬弓形蟲(chóng)(TOX)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)? 規(guī)格：48人份/盒 精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。
豬鏈球菌2型(SS-2)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)? 規(guī)格：48人份/盒 精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。
豬鏈球菌通用型(SS-U)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)? 規(guī)格：48人份/盒 精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。
禽流感病毒H9亞型(AIV-H9)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)? 規(guī)格：48人份/盒 精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。
禽流感病毒H7N9亞型(AIV-H7N9)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)? 規(guī)格：48人份/盒 精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。
禽流感病毒H7亞型(AIV-H7)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)? 規(guī)格：48人份/盒 精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。
禽流感病毒H5亞型(AIV-H5)核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)? 規(guī)格：48人份/盒 精密度：批內(nèi)、批間精密度檢測(cè) Ct 值的變異系數(shù)（CV）均小于等于 3%。
