大鼠尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)檢測試劑盒

使用說明書

大鼠尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)檢測試劑盒檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心法：抗大鼠尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)單抗包被于酶標板上，標本和標準品中的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)會與單抗結合，游離的成份被洗去。加入酶標抗體，抗大鼠尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)抗體與結合在單抗上的大鼠尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)結合而形成**復合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物，若反應孔中有尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)，辣根過氧化物酶會使無色的顯色劑現藍色，加終止液變黃。在450nm處測OD值，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)濃度與OD450值之間呈正比，可通過繪制標準曲線求出標本中的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)濃度。

選用世界有名生產廠家的原料，采用專業體外診斷試劑生產技術制造。適用于體外定量檢測大鼠血清、血漿或細胞培養上清液中天然重組大鼠尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)濃度。僅供科研使用，使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分。

大鼠尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)檢測試劑盒組成：

相關試劑在分裝時會比標簽上標明的體積稍多一些，請在使用時量取而非直接倒出！

大鼠尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)檢測試劑盒樣品收集:

1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內**試管。

2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。

3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會

影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。*后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4. 細胞培養上清：取細胞培養上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。

5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測

6. 樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。

7. 樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內檢測)，或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融。

8. 如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品*高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋（建議先做預實驗，以確定稀釋倍數）。

試驗所需自備物品:

1. 酶標儀(450nm波長濾光片)

2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

4. 吸水紙

大鼠尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)檢測試劑盒檢測前準備工作:

1. 請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正常現象，可用40℃水浴微加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應為室溫）。當日使用。

3. 標準品: 于10000×g離心1分鐘，加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中，旋緊管蓋，靜置10分鐘，上下顛倒數次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為20ng/mL。）。然后根據需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：按照稀釋方法圖例 標準品&樣品稀釋液直接作為空白孔0ng/mL。如配制5ng/mL標準品：取0.5mL10ng/mL的上述標準品加入含有0.5mL標準品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。  

4. 生物素化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作濃度。當日使用。

5. 酶結合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制100-200μL。使用前15分鐘，以酶結合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結合物(1:100)成工作濃度。

當日使用。

標準品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據實際用量來稀釋，如200μL/管）

 洗滌方法:

任何一個成功的ELISA檢測，正確的洗板方法是非常關鍵和重要的一方面。連貫的洗板也很有必要的。在稀釋濃縮洗滌液時，請使用去離子水或者蒸餾水。

◆ 洗滌瓶或多通道移液器

保證洗瓶內壓強良好或者移液器的管頭被適當調整并且無碎屑。檢查板內的板條是否安好。將板條編號以防在傾泄的時候松動便于調整。首先，傾泄酶標板以清空內容物。根據試劑盒內推薦的體積向每孔內滴加洗液。若實驗步驟中要求浸泡，則定時將每孔浸泡完全。將板內液體傾倒完全，用干凈紙巾擦拭。按照說明書所示重復以上步驟。*后一次洗板之后，將板內液體傾倒完全，用干凈紙巾拍打表面并擦干。切勿讓孔內干燥。按照試劑盒內說明書迅速進行下一步實驗操作。

◆ 自動洗板儀

將自動洗板儀接入適當真空（根據制造商的說明）。確保每管都被適當抽吸。首先，通過吸或者傾倒將板清空。根據試劑盒內推薦的體積向每孔內滴加洗液。若實驗步驟中要求浸泡，則定時將每孔浸泡完全。完全抽吸各孔，保證沒有洗液殘留。在孔內液體被完全抽走之后不要再將裝置至于孔內過分抽吸。按照說明書所示重復以上步驟。*后一次洗板之后，將板內液體傾倒完全，用干凈紙巾拍打表面并擦干。切勿讓孔內干燥。按照試劑盒內說明書迅速進行下一步實驗操作。

操作步驟:

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。

1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕藴势?amp;樣品稀釋液 100μL，余孔分別加標準品或待測樣品 100μL，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育 90 分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中加入生物素化抗體工作液 100μL（在使用前15 分鐘內配制），酶標板加上覆膜，37℃溫育 1 小時。

3. 棄去孔內液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干。

4. 每孔加酶結合物工作液（臨用前 15 分鐘內配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育30 分鐘。

5. 棄去孔內液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟3。

6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶標板加上覆膜37℃避光孵育15 分鐘左右（根據實際顯**況酌情縮短或延長，但不可超過30 分鐘。當標準孔出現明顯梯度時，即可終止）。

7. 每孔加終止液 50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液的加入順序相同。

8. 立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。應提前打開酶標儀電源，預熱儀器，設置好檢測程序。

9. 實驗完畢后將未用完的試劑按規定的保存溫度放回冰箱保存。

大鼠尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)檢測試劑盒注意事項：

◆ 仔細閱讀說明書。

◆ 檢查試劑盒標簽上的有效期。如果超過有效期，請勿使用。

◆ 按說明書確定所有試劑齊全（數量、體積）。

◆ 標本制備要規范，每份標本體積要按2-3個復孔以上的量制備（貯存），盡量分裝做備份。短期內無法實驗者，注意低溫保存。

◆ 準備好所有實驗額外所需物品，（比如移液器，試管，清洗器，酶標儀）。

◆ 按說明書將所用試劑平衡至室溫，根據檢測標本數量確定所需試劑的量。

◆ 檢查試劑盒內每種試劑的貯存條件，保證所有試劑均按照試劑盒內說明書推薦的條件存儲。

◆ 檢查不穩定或者變質的試劑溶液（比如沉淀或變色）。有些試劑，比如標準品稀釋液或者檢測稀釋液，可能在設計時就含有沉淀物。所有試劑在滴入酶標板之前，必需充分混勻。而由于沉淀物的特性，在加入酶標板之前，必需不停攪拌。

◆ 保證充分的孵育時間和溫度。

◆ 切勿使用不同生產批號的試劑取代現有試劑或混合現有試劑。

◆ 在混合或溶解蛋白溶液時，避免泡沫產生。

◆ 在實驗開始之前，安排好實驗流程。

◆ 在實驗開始之前，清潔工作臺。

◆ 若有問題，應與我公司或代理商的技術支持聯系  

結果判斷:

1. 每個標準品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設置復孔，則應取其平均值計算。以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標，標準品的濃度為縱坐標，繪出標準曲線。

2. 推薦使用專業的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據樣品OD值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

3. 若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。

大鼠尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)檢測試劑盒靈敏度、檢測范圍、特異性和重復性:

●靈敏度：*小可測：0.128ng/mL

●檢測范圍：0.313-20ng/mL

● 重復性：板內，板間變異系數均<10%。

● 特異性:可檢測重組或天然的大鼠尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)，且與其它相關蛋白無交叉反應。

操作概要

1. 在各孔中加入標準品或樣品各 100μL， 37℃孵育 90 分鐘

2. 倒去孔內液體，加入 100μL 生物素化抗體工作液，37℃孵育 60 分鐘

3. 洗滌 3 次

4. 加入 100μL 酶結合物工作液， 37℃孵育 30 分鐘

5. 洗滌 5 次

6. 加入 90μL 底物溶液， 37℃孵育 15 分鐘左右

7. 加入 50μL 終止液，立即在 450nm 波長處測量 OD 值

8. 結果計算  

問題分析

若實驗效果不好，請及時對顯色結果拍照，保留所用板條及未使用試劑，并妥善保存，然后

聯系我公司技術支持為您解決問題。

我是按照實驗步驟進行測定的，但是沒有任何信號，為什么？

◆ 對于使用HRP底物的比色測定，終止液的加入會使底物變色。而說明書推薦的波長就是*適波長。

◆ 通過輕拍酶標板的邊緣充分混合孔內試劑。加入終止液的時，顏色由藍變黃（如果是HRP

底物）。如果加終止液之前孔內試劑沒有混合，則底物顏色變綠。

◆ 可能加入試劑的順序錯誤。

◆ 加入底物溶液以后不要清洗酶標板。

◆ 在連續稀釋時確定已經加入標準品。

◆ 如果底物系統中有兩個成分，則必需混合均勻。

◆ 確定酶標儀的使用和操作正確。

◆ 確定試劑，標準品，樣品都正確配制并按照說明滴加無誤。

◆ 對于高敏感性試劑盒，確定使用的底物和放大劑都正確稀釋。